2024年1月7日，南方科技大學(xué)前沿生物技術(shù)研究院朱健康院士課題組題為“An engineered Cas12i nuclease that is an efficient genome editing tool in animals and plants”的研究論文在國(guó)際著名期刊The Innovation在線發(fā)表。該研究基于AI預(yù)測(cè)Cas12i3與核酸互作位點(diǎn)，并通過對(duì)Cas核酸識(shí)別區(qū)域候選點(diǎn)突進(jìn)行組合獲得了高編輯活性的優(yōu)化版本Cas-SF01，為疾病治療和動(dòng)植物基因編輯提供高效新工具（圖1）。
近十年來，CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)快速發(fā)展，已在基礎(chǔ)研究、動(dòng)植物育種、核酸檢測(cè)和基因治療等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。Cas蛋白是基因編輯系統(tǒng)的核心元件，除了II型的Cas9，包括V-I 型的Cas12i家族蛋白等其他類型的Cas蛋白也相繼被鑒定和解析。相較于Cas9，Cas12i蛋白尺寸相對(duì)更小，可以加工crRNA，能識(shí)別富含AT的PAM序列。自然存在的Cas蛋白普遍存在效率低，識(shí)別范圍小等缺點(diǎn)，而通過蛋白質(zhì)進(jìn)化及改造可實(shí)現(xiàn)Cas蛋白的活性提升，提升其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
圖1 Cas12i 活性改造策略
在本研究中，研究人員首先利用AlphaFold2預(yù)測(cè)了Cas12i3的三維結(jié)構(gòu)，并將該結(jié)構(gòu)與同家族的Cas12i1和Cas12i2蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)Cas12i3蛋白與核酸互作的氨基酸位點(diǎn)。通過對(duì)預(yù)測(cè)位點(diǎn)的突變建立一個(gè)150個(gè)點(diǎn)突變文庫(kù)，研究人員利用熒光報(bào)告系統(tǒng)篩選到26個(gè)活性提升到1.5倍以上的Cas12i3變體。進(jìn)一步通過對(duì)Cas12i3的REC結(jié)構(gòu)域和WED結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突進(jìn)行組合并進(jìn)行編輯效率分析，研究人員獲得了活性提升約4倍的Cas-SF01（S7R/D233R/D267R/N369R/S433R）。與普遍使用的SpCas9和Cas12a蛋白相比，Cas-SF01在多個(gè)內(nèi)源靶點(diǎn)的編輯效率超過了普遍使用的SpCas9和Cas12a，而在PAM識(shí)別方面，Cas-SF01展現(xiàn)出對(duì)TTN以外ATN及TTVN 的識(shí)別。此外，通過引入RuvC-II結(jié)構(gòu)域的D876R單點(diǎn)突變，研究人員進(jìn)一步獲得了特異性顯著提高的高保真版本Cas-SF01HiFi（圖2）。
圖2基于AI預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的高活性Cas-SF01設(shè)計(jì)、篩選組合、活性及PAM擴(kuò)展測(cè)試
結(jié)合LNP脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)，通過體內(nèi)靶向小鼠的Ttr基因，Cas-SF01實(shí)現(xiàn)了與Cas9相當(dāng)?shù)木庉嬓?。在單子葉植物水稻多位點(diǎn)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株系中，優(yōu)化版本Cas-SF01顯著提高編輯效率，達(dá)到75%左右。在雙子葉植物辣椒和大豆的發(fā)根系統(tǒng)中，自然版本的Cas12i3未能檢測(cè)到編輯事件，而Cas-SF01則表現(xiàn)出50%左右的編輯效率。以上數(shù)據(jù)表明Cas-SF01在動(dòng)物及單雙子葉植物中都能高效地編輯目的基因（圖3）。綜合而言，此項(xiàng)工作開發(fā)出了高效特異的基因編輯工具Cas-SF01，為將來的動(dòng)植物基因編輯和基因治療提供高效平臺(tái)。
圖3 Cas-SF01在動(dòng)植物中都有高效的基因編輯效率
南方科技大學(xué)前沿生物技術(shù)研究院博士后段志強(qiáng)和訪問學(xué)者梁亞峰為本論文的共同第一作者，南方科技大學(xué)前沿生物技術(shù)研究院博士后孫加雷、研究助理教授洪葉淳、醫(yī)學(xué)院助理教授田瑞琳等參與本研究工作并提供重要的實(shí)驗(yàn)支持。南方科技大學(xué)前沿生物技術(shù)研究院院長(zhǎng)朱健康院士為論文的通訊作者。南科大為論文第一單位。本項(xiàng)工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金和山東舜豐生物科技有限公司等支持。
論文鏈接：https://www.cell.com/the-innovation/fulltext/S2666-6758(24)00002-X